共聚焦顯微鏡（CLSM）具有成像分辨率高、Z軸深度分辨率高這兩個特點[1]。這意味著使用共聚焦顯微鏡可以對某一區(qū)域的生物組織樣本進(jìn)行圖像顯示，并通過不斷調(diào)節(jié)Z軸深度，對一定Z軸深度范圍內(nèi)的生物組織進(jìn)行成像，并通過疊加各個深度的二位成像，得到該區(qū)域生物組織的三維圖像重構(gòu)圖。是經(jīng)過了很多年的發(fā)展才實現(xiàn)了完成顯微鏡所需的激光束掃描。經(jīng)過不斷地發(fā)展，最終實現(xiàn)了使用聚焦激光束對樣品進(jìn)行點對點掃描，完成二維圖像重構(gòu)，再到后期的三維成像。

傳統(tǒng)顯微鏡進(jìn)行成像時深度分辨率較差，而使用共聚焦顯微鏡可以對樣品某一層進(jìn)行成像，具有較高的深度分辨率，進(jìn)而可以對樣本進(jìn)行三維成像。

工作原理1：

使用激光器發(fā)射出一束激光作為光源，輸出的激光通過一個物鏡聚焦在樣品表面。通過改變激光束聚焦在樣品的位置，實現(xiàn)激光聚焦點在樣品一片區(qū)域內(nèi)的掃描。產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)過一個小孔后，被光電探測器收集，小孔與焦平面處樣本成共軛關(guān)系，離焦熒光信號被濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定層析能力。采集激光束掃描至每一點時激勵光與樣本反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，經(jīng)過圖像重構(gòu)得到該片樣本區(qū)域的熒光成像。

工作原理2：

經(jīng)過光強調(diào)節(jié)后的激勵光進(jìn)入一個由兩個可快速精密調(diào)節(jié)角度反射鏡組成的XY反射鏡組。兩個反射鏡分別對應(yīng)X軸Y軸方向，通過調(diào)節(jié)兩個反射角度，使得經(jīng)過XY反射鏡組的出射激勵光在一定面積的平面范圍內(nèi)按一定軌跡進(jìn)行掃描。常見的掃描軌跡有柵格形（Raster）掃描軌跡、螺旋形（Spiral）掃描軌跡。

掃描過程中的入射激勵光會與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，一部分熒光會沿與入射激勵光相反的方向在先后通過物鏡和XY反射鏡組后進(jìn)入二向色鏡（Beam Splitter）中，分光鏡會反射激勵光，同時不會反射信號光，起到分離激勵光與熒光的作用。

經(jīng)過分光鏡后的熒光進(jìn)入到物鏡中再次被匯聚成為焦點，并在這個熒光焦點處加入針孔（Pinhole），此熒光焦點與樣本處焦點具有對應(yīng)關(guān)系，樣本焦平面以外產(chǎn)生的熒光信號在經(jīng)過針孔時會被遮擋住，因此僅有樣本焦平面產(chǎn)生的熒光信號會通過針孔，針孔起到濾波作用，使得共聚焦顯微鏡具有深度辨析能力。

經(jīng)過針孔后的熒光信號具有較強的層析能力，同時由于光強較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測器進(jìn)行探測。在此一般使用光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）將熒光信號放大并轉(zhuǎn)換為電信號，此電信號為模擬信號。光電倍增管可以在不引入噪聲的情況下將微弱的光信號放大約一百萬倍。光電探測器輸出的電信號強度與輸入熒光強度成正比。經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換成，與熒光強度成正比的電信號隨后由模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，此數(shù)字信號對應(yīng)樣本焦點處熒光信號強度。隨XY反射鏡組掃描，通過探測特定深度樣本區(qū)域內(nèi)的熒光信號，得到每一點熒光強度對應(yīng)的數(shù)字信號值，經(jīng)過計算機(jī)圖像處理將每一個數(shù)字信號值轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的灰度值，每一灰度信號值對應(yīng)一個像素點，將每個灰度信號與激勵光掃描軌跡相對應(yīng)得到成像圖。

共聚焦顯微鏡特點

共聚焦激光掃描顯微鏡通過引入小孔，使得顯微鏡具有深度分辨率，成像質(zhì)量增加。并且通過對體樣本進(jìn)行斷層步進(jìn)成像，通過后期圖像處理可以得到體樣本三維立體成像。

因為共聚焦顯微鏡為點掃描成像，所以其成像速度相對較慢。

共聚焦顯微鏡應(yīng)用

為使用共聚焦顯微鏡對葵花花粉進(jìn)行5微米步進(jìn)斷層成像示意圖，激勵光為488nm（綠）和543nm（紅）雙波長配合激勵，所得成像分辨率為3微米。通過將圖 4中每一層的成像按順序重組，可以得到如圖 5所示的葵花花粉三維成像圖。